Servizio di identificazione e quantificazione delle tossine algali in matrici acquatica e tissutale

La contaminazione da microcistine nei tessuti dei pesci è una rilevazione recente nei laghi italiani e il suo monitoraggio richiede tecniche di analisi veloci e precise, facili da applicare e capaci di fornire risultati in tempo reale. L’analisi chimica strumentale viene per lo più usata in senso confermativo e identificativo delle diverse varianti di microcistine.

Data la percentuale maggioritaria di tossine combinate direttamente alle cellule nei tessuti (in larga parte invisibili ai metodi strumentali) rispetto a quelle libere, e la necessità di usare i vari standard per il riconoscimento dei singoli composti, l’uso contemporaneo dell’analisi ELISA garantisce una rapida misurazione quantitativa del totale delle MC presenti, vantaggiosa dal punto di vista della valutazione del rischio. Gli studi effettuati sui laghi italiani hanno mostrato che i risultati dei test ELISA davano concentrazioni di MC da 3 a 8 volte superiori alla concentrazione calcolata dalle analisi LC-MS/MS ¹⁾.

La clorofilla è una molecola costituita da un anello porfirinico i cui quattro atomi centrali di azoto sono coordinati con uno ione Mg²⁺ centrale e una lunga catena idrocarburica laterale di fitolo. Essa ha la funzione di accettore di elettroni durante l’eccitazione provocata dai fotoni e consente quindi l’inizio della sintesi fotochimica che permetterà alle piante e alle alghe di avere un metabolismo di tipo autotrofo. Con la determinazione della clorofilla a presente in un campione prelevato è possibile valutare la quantità complessiva delle alghe che compongono il fitoplancton in sospensione. Dopo aver concentrato le cellule fitoplanctoniche su un filtro tramite filtrazioni di almeno 250 mL di campione, la clorofilla a viene estratta in soluzione acquosa di acetone al 90% e la sua determinazione viene effettuata mediante spettrofotometria, avvalendosi della capacità di tale pigmento di assorbire nelle lunghezze d’onda dello spettro visibile corrispondenti al rosso. Il picco di assorbimento della clorofilla a, infatti, cade tra 0,5 e 2,0 µm: si misura l’assorbanza del surnatante alle lunghezze d’onda di 750, 663, 645, 630 nm utilizzando un bianco costituito dalla soluzione di acetone al 90%. La lettura dell’estratto a 750 nm fornisce una misura della torbidità dell’estratto che non deve superare 0,01 unità di assorbanza. In caso contrario è necessario ripetere il procedimento di chiarificazione. Per il calcolo dei risultati, infine, è necessario inserire le assorbanze (A) come indicato in Strickland & Parsons (1997) ²⁾:

dove:

Ve = volume (mL) dell’estratto
Vf = volume (mL) del filtrato

I campioni vengono posti a sedimentare in appositi pozzetti di plexiglass con fondo trasparente e capacità di 25 mL per un periodo di 24 ~ 48 ore, poi esaminati all’invertoscopio. Le tecniche di conta algale usate sono quella per striscia e quella per campo. La tecnica per strisce raccomanda di contare strisce perpendicolari attraverso il centro del fondocamera. L’ampiezza delle strisce è costante per ogni serie di campioni. Il calcolo del numero di cellule per millilitro si effettua con la formula:

dove C è il numero di organismi contati; At è l’area totale del fondocamera in mm²; L è la lunghezza di una striscia in mm; W è l’ampiezza di una striscia in mm; S è il numero di strisce contate e V è il volume del campione nella camera in mL. La tecnica di conta per campo prevede l’esame casuale di campi non sovrapponentisi fino a contare 100 unità della specie dominante. Il calcolo si esegue mediante la formula:

dove Af è l’area di un campo in mm² ed F è il numero dei campi contati.

I campioni di acqua vengono estratti come segue: aliquote di fitoplancton fresco (10 ~ 130 mg) ottenute mediante centrifugazione di campioni di acqua, vengono sospese in 1 mL di acqua bidistillata sterile. La soluzione viene agitata, sonicata 5 minuti a 30 ~ 40 °C in un bagno a ultrasuoni (con agitazione per 20 secondi su vortex a metà del tempo), quindi centrifugata per 10 min a 11000 rpm (Beckman L5–55 Ultracentrifuge) per eliminare i residui. Il surnatante viene raccolto, il pellet viene nuovamente sospeso e l’intero processo viene ripetuto due volte. I due surnatanti sono uniti e analizzati per le microcistine intracellulari³⁾.

Circa 5 g di tessuto vengono omogeneizzati per 15 secondi con 10 mL di metanolo (MeOH) al 100% (purezza per HPLC) e centrifugati a 5000 g per 5 minuti. L’estrazione viene ripetuta sul pellet e i surnatanti raccolti vengono quindi filtrati su filtri di carta, i filtrati raggruppati e portati a un volume di 25 mL con MeOH al 100%; 5 mL del volume ottenuto vengono diluiti con 5 mL di acqua distillata e caricati su una cartuccia WatersTM Oasis HLB 6 cc Vac Cartridge precondizionata con 1 mL di MeOH al 100% seguiti da 1 mL di acqua distillata. Il campione viene eluito con 1 mL di MeOH/H2O al 5% e poi raccolto con 1 mL di MeOH. La frazione MeOH al 100% viene essiccata e quindi disciolta in acqua (2 mL). Questa sospensione viene conservata a -30 °C per successive analisi di microcistine (MC) ⁴⁾.

Circa 5 g di tessuto vengono omogeneizzati in 10 mL 100% MeOH per 15 min, poi sonicati 5 min a 30 ~ 40 °C in un bagno ultrasonico (a 25 kHz) a temperatura ambiente, per rompere le cellule. L’omogenato viene quindi centrifugato per 5 min a 5000 g e il surnatante decantato e filtrato. L’estrazione viene ripetuta sul pellet, il campione viene centrifugato e il supernatante filtrato sullo stesso filtro precedentemente utilizzato. Il filtro e l’imbuto vengono lavati tre volte con piccoli volumi di MeOH; i due estratti e i lavaggi vengono raccolti insieme, quindi essiccati con Rotavapor a 40 °C; il residuo risospeso in 2 mL di acqua distillata viene poi conservato a -30 °C fino all’analisi.

Circa 5 g di tessuto muscolare vengono omogeneizzati per 15 min e poi liofilizzati. Il liofilizzato viene polverizzato e un’aliquota di 100 mg viene posta in una fiala di polipropilene con 3 mL di acido tricloroacetico 0,1 N (TCA), dispersa con agitazione su Vortex ed estratta su un mescolatore a rulli per 1,5 h. Dopo centrifugazione per 10 minuti a 3500 g, il supernatante viene trasferito in provette filtranti (PVDF filter, 5 µm) e ulteriormente centrifugato per 10 minuti a 3500 g. Il supernatante viene poi purificato utilizzando cartucce a scambio cationico (Oasis-MCX, 6 cc, Waters) precedentemente condizionate e attivate con 5 mL di metanolo seguiti da 5 mL di acqua distillata; dopo il caricamento del campione la cartuccia viene lavata con 5 mL di acido cloridrico 0,1 N; la tossina viene eluita con 4 mL di soluzione di idrossido di ammonio al 2% in metanolo/acqua (75/25, v/v). La soluzione eluita viene poi essiccata a 50 °C sotto una leggera corrente di azoto e il residuo disciolto in 5 mL di acqua distillata per l’esame ELISA.

Il test anti-ADDA (ABRAXIS, USA) è un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, saggio immuno-assorbente legato a un enzima) competitivo indiretto per la rivelazione indipendente di congeneri di microcistine e nodularine. Si basa sul riconoscimento di microcistine, nodularine e loro congeneri per specifici anticorpi. La tossina, se presente in un campione, e un analogo del peptide microcistina immobilizzato sulla piastra, competono per i siti di legame degli anticorpi anti-microcistine/nodularine in soluzione. La piastra viene quindi lavata e viene aggiunto un secondo anticorpo-HRP (Horseradish Peroxidase, enzima perossidasi di rafano).

Dopo una seconda fase di lavaggio e aggiunta del substrato, nella soluzione viene generata una colorazione blu. L’intensità del colore è inversamente proporzionale alla concentrazione di microcistine presenti nel campione. La reazione colorimetrica viene interrotta dopo un tempo specifico e l’intensità del colore viene misurata utilizzando un lettore spettrofotometrico ELISA. Le concentrazioni dei campioni sono determinate da un’interpolazione usando la curva standard costruita con ogni lettura. Il test non distingue tra Microcistina-LR e altre varianti di microcistine, ma rileva la loro presenza globale. Il limite di rivelazione (Limit of Detection, LOD) per questo test, basato su MC-LR, è di 0,10 ppb (μg/L). I coefficienti di variazione (CV%) per gli standard sono inferiori al 10%; per i campioni inferiori al 15%.

Campioni di acqua, estratti di cellule cianobatteriche ed estratti di tessuto vengono analizzati utilizzando l’ELISA Abraxis per cilindrospermopsine (Abraxis Bioscience CA), seguendo le istruzioni del produttore e utilizzando le concentrazioni di taratura suggerite. L’immunodosaggio ELISA di Abraxis dichiara come limite di rivelazione (Limit of detection, LOD) 0,04 ng/mL, con coefficiente di variazione percentuale (CV%) inferiore al 10% per lo standard e inferiore al 15% per i campioni.

Il test attualmente disponibile (ABRAXIS, USA) è un test ELISA competitivo diretto basato sul riconoscimento della BMAA da parte di anticorpi specifici. BMAA, se presente in un campione, e un analogo BMAA-HRP competono per i siti di legame degli anticorpi anti-BMAA di coniglio in soluzione. Gli anticorpi BMAA sono poi legati da un secondo anticorpo immobilizzato sui pozzetti della piastra di microtitolazione. Dopo una fase di lavaggio e l’aggiunta della soluzione di substrato, viene generato un segnale di colore. L’intensità del colore blu è inversamente proporzionale alla concentrazione di BMAA presente nel campione. La reazione del colore viene fermata dopo un tempo specificato e il colore viene valutato utilizzando un lettore di micropiastre ELISA. Le concentrazioni dei campioni sono determinate per interpolazione utilizzando la curva standard costruita con ciascuna prova. Il LOD per questo test, basato su MC-LR, è di 4 μg/L. I coefficienti di variazione (CV%) per gli standard sono inferiori al 10%; per i campioni inferiori al 15%.