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aree:proteomica:ms:linee_guida [2017/02/16 20:18]
Gianluca Frustagli 		aree:proteomica:ms:linee_guida [2017/02/16 20:19] (versione attuale)
Gianluca Frustagli
Linea 11: Linea 11:
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-====== Linee guida ======+===== Linee guida =====
  
-===== Contaminanti ​=====+==== Contaminanti ====
  
 La spettrometria di massa è una tecnica molto sensibile alla presenza di contaminanti,​ che se in eccesso potrebbero totalmente invalidare l'​analisi. Pertanto è essenziale minimizzare la contaminazione del campione. La spettrometria di massa è una tecnica molto sensibile alla presenza di contaminanti,​ che se in eccesso potrebbero totalmente invalidare l'​analisi. Pertanto è essenziale minimizzare la contaminazione del campione.
  
-===== Cheratine ​=====+==== Cheratine ====
  
 Le cheratine sono proteine ​​onnipresenti provenienti dalla pelle, capelli, polvere, vestiti, prodotti chimici, etc. La totale eliminazione è praticamente impossibile,​ ma per evitare la soppressione del segnale delle proteine d'​interesse è necessario utilizzare particolari accortezze nella preparazione e manipolazione del campione. Un ambiente di lavoro particolarmente attento è la migliore prevenzione ed è per questo che preferiamo correre/​tagliare i gel nel nostro laboratorio. Inoltre, è fortemente consigliato indossare __guanti in nitrile__ senza polvere in ogni momento della preparazione del campione. I __guanti in lattice__ spesso contengono amido, e quindi molte proteine. È preferibile utilizzare __contenitori monouso__ o dedicati (p.es. tubi da centrifuga). Qualora siate voi a preparare i gel, è fondamentale evitare di toccare contenitori e gel con le mani nude; utilizzare contenitori puliti dedicati alla colorazione (e non, ad esempio, quelli utilizzati per Western blot) e chiudere con un coperchio durante la colorazione/​storage. In assenza di coperchio __utilizzare carta argentata e **mai** Parafilm__. Non sporgersi sul gel, grattarsi la testa o la barba durante l'​interpretazione delle bande ;-) . Se si prende il gel dal contenitore (ad esempio per la scansione, il taglio), pulire accuratamente lo scanner con acqua (__senza sapone!__). Usare sempre soluzioni nuove per preparare e correre gel, inclusi tampone di corsa e sample buffer. È preferibile l’utilizzo di TCEP come riducente piuttosto che b-mercaptoetanolo o DTT. Le cheratine sono proteine ​​onnipresenti provenienti dalla pelle, capelli, polvere, vestiti, prodotti chimici, etc. La totale eliminazione è praticamente impossibile,​ ma per evitare la soppressione del segnale delle proteine d'​interesse è necessario utilizzare particolari accortezze nella preparazione e manipolazione del campione. Un ambiente di lavoro particolarmente attento è la migliore prevenzione ed è per questo che preferiamo correre/​tagliare i gel nel nostro laboratorio. Inoltre, è fortemente consigliato indossare __guanti in nitrile__ senza polvere in ogni momento della preparazione del campione. I __guanti in lattice__ spesso contengono amido, e quindi molte proteine. È preferibile utilizzare __contenitori monouso__ o dedicati (p.es. tubi da centrifuga). Qualora siate voi a preparare i gel, è fondamentale evitare di toccare contenitori e gel con le mani nude; utilizzare contenitori puliti dedicati alla colorazione (e non, ad esempio, quelli utilizzati per Western blot) e chiudere con un coperchio durante la colorazione/​storage. In assenza di coperchio __utilizzare carta argentata e **mai** Parafilm__. Non sporgersi sul gel, grattarsi la testa o la barba durante l'​interpretazione delle bande ;-) . Se si prende il gel dal contenitore (ad esempio per la scansione, il taglio), pulire accuratamente lo scanner con acqua (__senza sapone!__). Usare sempre soluzioni nuove per preparare e correre gel, inclusi tampone di corsa e sample buffer. È preferibile l’utilizzo di TCEP come riducente piuttosto che b-mercaptoetanolo o DTT.
  
-===== Altre proteine ​​contaminanti ​=====+==== Altre proteine ​​contaminanti ====
  
 Altre proteine ​​osservate spesso sono BSA, immunoglobuline e altre proteine ​​del siero. Questi di solito provengono da terreni di coltura cellulare e possono essere ridotti con ripetuti lavaggi dei pellet cellulari. Altre proteine ​​osservate spesso sono BSA, immunoglobuline e altre proteine ​​del siero. Questi di solito provengono da terreni di coltura cellulare e possono essere ridotti con ripetuti lavaggi dei pellet cellulari.
Linea 27: Linea 27:
 Nel caso di analisi su plasma/​siero è necessario utilizzare protocolli specifici per l'​eliminazione delle proteine più abbondanti. Nel caso di analisi su plasma/​siero è necessario utilizzare protocolli specifici per l'​eliminazione delle proteine più abbondanti.
  
-===== Polimeri ​=====+==== Polimeri ====
  
 I polimeri sono i contaminanti più dannosi, poiché oltre a sopprimere il segnale tendono ad attaccarsi alle colonne HPLC o ai capillari, danneggiando il sistema o quantomeno causando un grave effetto memoria sulle successive corse LC-MS. La maggior parte dei polimeri ionizza più facilmente dei peptidi e questo significa che anche piccole quantità possono essere deleterie per l'​esperimento. I polimeri più frequentemente osservati sono varie forme di PEG, presenti in alcune plastiche; ma anche in saponi, creme per le mani (__indossare guanti è indispensabile!__) e detergenti. Non è sempre facile rintracciare la fonte di una contaminazione da polimeri, ma una fonte certa è il __Parafilm__,​ da evitare assolutamente per chiudere tubi o bottiglie di solventi, o vaschette del gel etc. Inoltre, non dovrebbero essere presenti detergenti nei campioni da sottoporre MS, per questo motivo l'​analisi è sempre preceduta da PAGE o cromatografia. I polimeri sono i contaminanti più dannosi, poiché oltre a sopprimere il segnale tendono ad attaccarsi alle colonne HPLC o ai capillari, danneggiando il sistema o quantomeno causando un grave effetto memoria sulle successive corse LC-MS. La maggior parte dei polimeri ionizza più facilmente dei peptidi e questo significa che anche piccole quantità possono essere deleterie per l'​esperimento. I polimeri più frequentemente osservati sono varie forme di PEG, presenti in alcune plastiche; ma anche in saponi, creme per le mani (__indossare guanti è indispensabile!__) e detergenti. Non è sempre facile rintracciare la fonte di una contaminazione da polimeri, ma una fonte certa è il __Parafilm__,​ da evitare assolutamente per chiudere tubi o bottiglie di solventi, o vaschette del gel etc. Inoltre, non dovrebbero essere presenti detergenti nei campioni da sottoporre MS, per questo motivo l'​analisi è sempre preceduta da PAGE o cromatografia.