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aree:proteomica:biacore:metodica [2021/11/30 13:49]
Gianluca Frustagli creata 		aree:proteomica:biacore:metodica [2022/07/27 19:20]
Gianluca Frustagli Aggiunta link al modulo per la richiesta di servizio.
Linea 6: Linea 6:
  
 <WRAP tabs> <WRAP tabs>
 +  * [[:​aree:​proteomica:​biacore:​richiesta|Richiesta servizio]]
   * [[:​aree:​proteomica:​biacore:​start|Introduzione]]   * [[:​aree:​proteomica:​biacore:​start|Introduzione]]
   * [[:​aree:​proteomica:​biacore:​metodica|Metodica]]   * [[:​aree:​proteomica:​biacore:​metodica|Metodica]]
Linea 26: Linea 27:
 {{ :​aree:​proteomica:​biacore:​il_sistema_biacore.png?​600 |}} {{ :​aree:​proteomica:​biacore:​il_sistema_biacore.png?​600 |}}
  
-Questo principio viene sfruttato dal **Biacore X-100**, commercializzato da Cytiva. Gli elementi fondamentali dello strumento sono:+Questo principio viene sfruttato dal **Biacore X-100**, commercializzato da Cytiva. 
 + 
 +Gli elementi fondamentali dello strumento sono:
  
   * **Il chip.** Descriviamo qui un chip //​“General Purpose“//​ di tipo CM (carbossi-metil destrano), ma ne esistono di diverse tipologie per applicazioni specifiche. Un sottile strato d’oro di 50 nm viene stratificato su un supporto di vetro. Sull’altro lato l’oro viene coperto di uno strato idrofobico di alcan tioli. Ed infine sui chip CM da uno strato idrofilico di carbossi-metil destrano. Tale molecola viene tipicamente utilizzata per immobilizzare sul chip ligandi proteici, ss-DNA, Anticorpi, Streptavidina,​ complessi chelanti. Ma è possibile immobilizzare anche ligandi lipidici, sia sotto forma di monostrato (chip HPA) che di bilayer (chip L1).   * **Il chip.** Descriviamo qui un chip //​“General Purpose“//​ di tipo CM (carbossi-metil destrano), ma ne esistono di diverse tipologie per applicazioni specifiche. Un sottile strato d’oro di 50 nm viene stratificato su un supporto di vetro. Sull’altro lato l’oro viene coperto di uno strato idrofobico di alcan tioli. Ed infine sui chip CM da uno strato idrofilico di carbossi-metil destrano. Tale molecola viene tipicamente utilizzata per immobilizzare sul chip ligandi proteici, ss-DNA, Anticorpi, Streptavidina,​ complessi chelanti. Ma è possibile immobilizzare anche ligandi lipidici, sia sotto forma di monostrato (chip HPA) che di bilayer (chip L1).
Linea 38: Linea 41:
 Il protocollo sperimentale viene elaborato grazie ad una interfaccia grafica che dichiara le operazioni che lo strumento dovrà svolgere durante l’esperimento definendo dei Report Point, dei descrittori e dei volumi da iniettare nel circuito fluidico. Una volta definito il protocollo sperimentale e caricati i campioni in un vassoio a revolver l’esperimento può iniziare. Il protocollo sperimentale viene elaborato grazie ad una interfaccia grafica che dichiara le operazioni che lo strumento dovrà svolgere durante l’esperimento definendo dei Report Point, dei descrittori e dei volumi da iniettare nel circuito fluidico. Una volta definito il protocollo sperimentale e caricati i campioni in un vassoio a revolver l’esperimento può iniziare.
  
 +{{ :​aree:​proteomica:​biacore:​absolute_response.png |}}
 +
 +Dopo un certo tempo di perfusione del campione, il sistema effettua un lavaggio con il //running buffer// durante il quale si ha il distacco delle molecole di analita che hanno interagito con il ligando. Infine, viene flussato un //tampone rigenerante//​ tipicamente molto salino e basico che consente di staccare tutte le molecole di analita dal ligando, rendendo disponibile il chip ad un nuovo ciclo di legame-distacco.
  
 ===== Il Sensogramma ===== ===== Il Sensogramma =====
Linea 43: Linea 49:
 {{ :​aree:​proteomica:​biacore:​il_sensogramma.png?​400 |}} {{ :​aree:​proteomica:​biacore:​il_sensogramma.png?​400 |}}
  
-Dal sensogramma possibile evincere sia informazioni cinetiche quali l’associazione e la dissociazione,​ fittando i dati ottenuti sperimentalmente con dei modelli teorici noti, come pure informazioni di tipo termodinamico (Entalpia, Entropia e Energia libera di Gibbs) legati al fatto che gli esperimenti possono essere fatti a temperatura controllata tra 4 e 45 °C.+Dal sensogramma ​è possibile evincere sia informazioni cinetiche quali l’associazione e la dissociazione,​ fittando i dati ottenuti sperimentalmente con dei modelli teorici noti, come pure informazioni di tipo termodinamico (Entalpia, Entropia e Energia libera di Gibbs) legati al fatto che gli esperimenti possono essere fatti a temperatura controllata tra 4 e 45 °C.