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Gianluca Frustagli [1. Estrazione clorofilla a da acqua]
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Gianluca Frustagli
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 **Servizi e strumenti in collaborazione**
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-dove **C** è il numero di organismi contati; **At** è l’area totale del fondocamera in mm<sup>2</sup>; **L** è la lunghezza di una striscia in mm; **W** è l’ampiezza di una striscia in mm; **S** è il numero di strisce contate e **V** è il volume del campione nella camera in mL. La tecnica di conta per campo prevede l’esame casuale di campi non sovrapponentisi fino a contare 100 unità della specie dominante. Il calcolo si esegue mediante la formula:
+dove **C** è il numero di organismi contati; **At** è l’area totale del fondocamera in mm²; **L** è la lunghezza di una striscia in mm; **W** è l’ampiezza di una striscia in mm; **S** è il numero di strisce contate e **V** è il volume del campione nella camera in mL. La tecnica di conta per campo prevede l’esame casuale di campi non sovrapponentisi fino a contare 100 unità della specie dominante. Il calcolo si esegue mediante la formula:
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-dove **Af** è l’area di un campo in mm2 ed **F** è il numero dei campi contati.
+dove **Af** è l’area di un campo in mm² ed **F** è il numero dei campi contati.
 ===== 3. Estrazione tossine da acqua =====
-I campioni di acqua vengono estratti come segue: aliquote di fitoplancton fresco (10-130 mg) ottenute mediante centrifugazione di campioni di acqua, vengono sospese in 1 mL di acqua bidistillata sterile. La soluzione viene agitata, sonicata 5 minuti a 30 ~ 40 °C in un bagno a ultrasuoni (con agitazione per 20 secondi su vortex a metà del tempo), quindi centrifugata per 10 min a 11000 rpm (Beckman L5–55 Ultracentrifuge) per eliminare i residui. Il surnatante viene raccolto, il pellet viene nuovamente sospeso e l’intero processo viene ripetuto due volte. I due surnatanti sono uniti e analizzati per le microcistine intracellulari((Bruno et al., 2009)).
+I campioni di acqua vengono estratti come segue: aliquote di fitoplancton fresco (10 ~ 130 mg) ottenute mediante centrifugazione di campioni di acqua, vengono sospese in 1 mL di acqua bidistillata sterile. La soluzione viene agitata, sonicata 5 minuti a 30 ~ 40 °C in un bagno a ultrasuoni (con agitazione per 20 secondi su vortex a metà del tempo), quindi centrifugata per 10 min a 11000 rpm (Beckman L5–55 Ultracentrifuge) per eliminare i residui. Il surnatante viene raccolto, il pellet viene nuovamente sospeso e l’intero processo viene ripetuto due volte. I due surnatanti sono uniti e analizzati per le microcistine intracellulari((Bruno et al., 2009)).
 ===== 4. Estrazione di microcistine da tessuti ittici =====
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 Il test anti-ADDA (ABRAXIS, USA) è un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, saggio immuno-assorbente legato a un enzima) competitivo indiretto per la rivelazione indipendente di congeneri di microcistine e nodularine. Si basa sul riconoscimento di microcistine, nodularine e loro congeneri per specifici anticorpi. La tossina, se presente in un campione, e un analogo del peptide microcistina immobilizzato sulla piastra, competono per i siti di legame degli anticorpi anti-microcistine/nodularine in soluzione. La piastra viene quindi lavata e viene aggiunto un secondo anticorpo-HRP (Horseradish Peroxidase, enzima perossidasi di rafano).
-Dopo una seconda fase di lavaggio e aggiunta del substrato, nella soluzione viene generata una colorazione blu. L’intensità del colore è inversamente proporzionale alla concentrazione di microcistine presenti nel campione. La reazione colorimetrica viene interrotta dopo un tempo specifico e l’intensità del colore viene misurata utilizzando un lettore spettrofotometrico ELISA. Le concentrazioni dei campioni sono determinate da un’interpolazione usando la curva standard costruita con ogni lettura. Il test non distingue tra Microcistina-LR e altre varianti di microcistine, ma rileva la loro presenza globale. Il limite di rivelazione (Limit of Detection, LOD) per questo test, basato su MC-LR, è di 0.10 ppb (μg/L). I coefficienti di variazione (CV%) per gli standard sono inferiori al 10%; per i campioni inferiori al 15%.
+Dopo una seconda fase di lavaggio e aggiunta del substrato, nella soluzione viene generata una colorazione blu. L’intensità del colore è inversamente proporzionale alla concentrazione di microcistine presenti nel campione. La reazione colorimetrica viene interrotta dopo un tempo specifico e l’intensità del colore viene misurata utilizzando un lettore spettrofotometrico ELISA. Le concentrazioni dei campioni sono determinate da un’interpolazione usando la curva standard costruita con ogni lettura. Il test non distingue tra Microcistina-LR e altre varianti di microcistine, ma rileva la loro presenza globale. Il limite di rivelazione (Limit of Detection, LOD) per questo test, basato su MC-LR, è di 0,10 ppb (μg/L). I coefficienti di variazione (CV%) per gli standard sono inferiori al 10%; per i campioni inferiori al 15%.
 ==== 7.2. Analisi di cilindrospermopsine ====