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| **Servizi e strumenti in collaborazione** | **Servizi e strumenti in collaborazione** | ||
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| - | <WRAP tabs> | + | ====== Servizio di identificazione e quantificazione delle tossine algali in matrici acquatica e tissutale ====== |
| - | * [[:aree:in_collaborazione:tossine_algali:|Descrizione]] | + | |
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| + | * [[:aree:in_collaborazione:tossine_algali:|Presentazione]] | ||
| * [[:aree:in_collaborazione:tossine_algali:metodi|Metodi di analisi]] | * [[:aree:in_collaborazione:tossine_algali:metodi|Metodi di analisi]] | ||
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| - | ====== Metodi di analisi ====== | ||
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| Linea 18: | Linea 14: | ||
| La contaminazione da microcistine nei tessuti dei pesci è una rilevazione recente nei laghi italiani e il suo monitoraggio richiede tecniche di analisi veloci e precise, facili da applicare e capaci di fornire risultati in tempo reale. L’analisi chimica strumentale viene per lo più usata in senso confermativo e identificativo delle diverse varianti di microcistine. | La contaminazione da microcistine nei tessuti dei pesci è una rilevazione recente nei laghi italiani e il suo monitoraggio richiede tecniche di analisi veloci e precise, facili da applicare e capaci di fornire risultati in tempo reale. L’analisi chimica strumentale viene per lo più usata in senso confermativo e identificativo delle diverse varianti di microcistine. | ||
| - | Data la percentuale maggioritaria di tossine combinate direttamente alle cellule nei tessuti (in larga parte invisibili ai metodi strumentali) rispetto a quelle libere, e la necessità di usare i vari standard per il riconoscimento dei singoli composti, l’uso contemporaneo dell’analisi ELISA garantisce una rapida misurazione quantitativa del totale delle MC presenti, vantaggiosa dal punto di vista della valutazione del rischio. Gli studi effettuati sui laghi italiani hanno mostrato che i risultati dei test ELISA davano concentrazioni di MC da 3 a 8 volte superiori alla concentrazione calcolata dalle analisi LC-MS/MS (Bruno et al., 2009). | + | Data la percentuale maggioritaria di tossine combinate direttamente alle cellule nei tessuti (in larga parte invisibili ai metodi strumentali) rispetto a quelle libere, e la necessità di usare i vari standard per il riconoscimento dei singoli composti, l’uso contemporaneo dell’analisi ELISA garantisce una rapida misurazione quantitativa del totale delle MC presenti, vantaggiosa dal punto di vista della valutazione del rischio. Gli studi effettuati sui laghi italiani hanno mostrato che i risultati dei test ELISA davano concentrazioni di MC da 3 a 8 volte superiori alla concentrazione calcolata dalle analisi LC-MS/MS ((Bruno et al., 2009)). |
| ===== 1. Estrazione clorofilla a da acqua ===== | ===== 1. Estrazione clorofilla a da acqua ===== | ||
| - | La clorofilla è una molecola costituita da un anello porfirinico i cui quattro atomi centrali di azoto sono coordinati con uno ione Mg<sup>2+</sup> centrale e una lunga catena idrocarburica laterale di fitolo. Essa ha la funzione di accettore di elettroni durante l’eccitazione provocata dai fotoni e consente quindi l’inizio della sintesi fotochimica che permetterà alle piante e alle alghe di avere un metabolismo di tipo autotrofo. Con la determinazione della clorofilla //a// presente in un campione prelevato è possibile valutare la quantità complessiva delle alghe che compongono il fitoplancton in sospensione. Dopo aver concentrato le cellule fitoplanctoniche su un filtro tramite filtrazioni di almeno 250 mL di campione, la clorofilla //a// viene estratta in soluzione acquosa di acetone al 90% e la sua determinazione viene effettuata mediante spettrofotometria, avvalendosi della capacità di tale pigmento di assorbire nelle lunghezze d’onda dello spettro visibile corrispondenti al rosso. Il picco di assorbimento della clorofilla //a//, infatti, cade tra 0,5 e 2,0 µm: si misura l’assorbanza del surnatante alle lunghezze d’onda di 750, 663, 645, 630 nm utilizzando un bianco costituito dalla soluzione di acetone al 90%. La lettura dell’estratto a 750 nm fornisce una misura della torbidità dell’estratto che non deve superare 0,01 unità di assorbanza. In caso contrario è necessario ripetere il procedimento di chiarificazione. Per il calcolo dei risultati, infine, è necessario inserire le assorbanze (A) come indicato in Strickland & Parsons (1997) (Rapporto ISTISAN 00/14 Pt.2): | + | La clorofilla è una molecola costituita da un anello porfirinico i cui quattro atomi centrali di azoto sono coordinati con uno ione Mg<sup>2+</sup> centrale e una lunga catena idrocarburica laterale di fitolo. Essa ha la funzione di accettore di elettroni durante l’eccitazione provocata dai fotoni e consente quindi l’inizio della sintesi fotochimica che permetterà alle piante e alle alghe di avere un metabolismo di tipo autotrofo. Con la determinazione della clorofilla //a// presente in un campione prelevato è possibile valutare la quantità complessiva delle alghe che compongono il fitoplancton in sospensione. Dopo aver concentrato le cellule fitoplanctoniche su un filtro tramite filtrazioni di almeno 250 mL di campione, la clorofilla //a// viene estratta in soluzione acquosa di acetone al 90% e la sua determinazione viene effettuata mediante spettrofotometria, avvalendosi della capacità di tale pigmento di assorbire nelle lunghezze d’onda dello spettro visibile corrispondenti al rosso. Il picco di assorbimento della clorofilla //a//, infatti, cade tra 0,5 e 2,0 µm: si misura l’assorbanza del surnatante alle lunghezze d’onda di 750, 663, 645, 630 nm utilizzando un bianco costituito dalla soluzione di acetone al 90%. La lettura dell’estratto a 750 nm fornisce una misura della torbidità dell’estratto che non deve superare 0,01 unità di assorbanza. In caso contrario è necessario ripetere il procedimento di chiarificazione. Per il calcolo dei risultati, infine, è necessario inserire le assorbanze (A) come indicato in //Strickland & Parsons (1997)// ((Rapporto ISTISAN 00/14 Pt.2)): |
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| - | µg/L = [11.64 (A<sub>663</sub> – A<sub>750</sub>) – 2.16 (A<sub>645</sub> – A<sub>750</sub>) – 0.10 (A<sub>663</sub> – A<sub>750</sub>)] Ve/Vf | + | µg/L = [11,64 (A<sub>663</sub> – A<sub>750</sub>) – 2,16 (A<sub>645</sub> – A<sub>750</sub>) – 0,10 (A<sub>663</sub> – A<sub>750</sub>)] Ve/Vf |
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| I campioni vengono posti a sedimentare in appositi pozzetti di plexiglass con fondo trasparente e capacità di 25 mL per un periodo di 24 ~ 48 ore, poi esaminati all’invertoscopio. Le tecniche di conta algale usate sono quella per striscia e quella per campo. La tecnica per strisce raccomanda di contare strisce perpendicolari attraverso il centro del fondocamera. L’ampiezza delle strisce è costante per ogni serie di campioni. Il calcolo del numero di cellule per millilitro si effettua con la formula: | I campioni vengono posti a sedimentare in appositi pozzetti di plexiglass con fondo trasparente e capacità di 25 mL per un periodo di 24 ~ 48 ore, poi esaminati all’invertoscopio. Le tecniche di conta algale usate sono quella per striscia e quella per campo. La tecnica per strisce raccomanda di contare strisce perpendicolari attraverso il centro del fondocamera. L’ampiezza delle strisce è costante per ogni serie di campioni. Il calcolo del numero di cellule per millilitro si effettua con la formula: | ||
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| - | dove **C** è il numero di organismi contati; **At** è l’area totale del fondocamera in mm<sup>2</sup>; **L** è la lunghezza di una striscia in mm; **W** è l’ampiezza di una striscia in mm; **S** è il numero di strisce contate e **V** è il volume del campione nella camera in mL. La tecnica di conta per campo prevede l’esame casuale di campi non sovrapponentisi fino a contare 100 unità della specie dominante. Il calcolo si esegue mediante la formula: | + | \\ |
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| + | dove **C** è il numero di organismi contati; **At** è l’area totale del fondocamera in mm²; **L** è la lunghezza di una striscia in mm; **W** è l’ampiezza di una striscia in mm; **S** è il numero di strisce contate e **V** è il volume del campione nella camera in mL. La tecnica di conta per campo prevede l’esame casuale di campi non sovrapponentisi fino a contare 100 unità della specie dominante. Il calcolo si esegue mediante la formula: | ||
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| Linea 48: | Linea 54: | ||
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| - | dove **Af** è l’area di un campo in mm2 ed **F** è il numero dei campi contati. | + | \\ |
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| + | dove **Af** è l’area di un campo in mm² ed **F** è il numero dei campi contati. | ||
| ===== 3. Estrazione tossine da acqua ===== | ===== 3. Estrazione tossine da acqua ===== | ||
| - | I campioni di acqua vengono estratti come segue: aliquote di fitoplancton fresco (10-130 mg) ottenute mediante centrifugazione di campioni di acqua, vengono sospese in 1 mL di acqua bidistillata sterile. La soluzione viene agitata, sonicata 5 minuti a 30 ~ 40 °C in un bagno a ultrasuoni (con agitazione per 20 secondi su vortex a metà del tempo), quindi centrifugata per 10 min a 11000 rpm (Beckman L5–55 Ultracentrifuge) per eliminare i residui. Il surnatante viene raccolto, il pellet viene nuovamente sospeso e l’intero processo viene ripetuto due volte. I due surnatanti sono uniti e analizzati per le microcistine intracellulari (Bruno et al., 2009). | + | I campioni di acqua vengono estratti come segue: aliquote di fitoplancton fresco (10 ~ 130 mg) ottenute mediante centrifugazione di campioni di acqua, vengono sospese in 1 mL di acqua bidistillata sterile. La soluzione viene agitata, sonicata 5 minuti a 30 ~ 40 °C in un bagno a ultrasuoni (con agitazione per 20 secondi su vortex a metà del tempo), quindi centrifugata per 10 min a 11000 rpm (Beckman L5–55 Ultracentrifuge) per eliminare i residui. Il surnatante viene raccolto, il pellet viene nuovamente sospeso e l’intero processo viene ripetuto due volte. I due surnatanti sono uniti e analizzati per le microcistine intracellulari((Bruno et al., 2009)). |
| ===== 4. Estrazione di microcistine da tessuti ittici ===== | ===== 4. Estrazione di microcistine da tessuti ittici ===== | ||
| - | Circa 5 g di tessuto vengono omogeneizzati per 15 secondi con 10 mL di metanolo (MeOH) al 100% (purezza per HPLC) e centrifugati a 5000 g per 5 minuti. L’estrazione viene ripetuta sul pellet e i surnatanti raccolti vengono quindi filtrati su filtri di carta, i filtrati raggruppati e portati a un volume di 25 mL con MeOH al 100%; 5 mL del volume ottenuto vengono diluiti con 5 mL di acqua distillata e caricati su una cartuccia WatersTM Oasis HLB 6 cc Vac Cartridge precondizionata con 1 mL di MeOH al 100% seguiti da 1 mL di acqua distillata. Il campione viene eluito con 1 mL di MeOH/H2O al 5% e poi raccolto con 1 mL di MeOH. La frazione MeOH al 100% viene essiccata e quindi disciolta in acqua (2 mL). Questa sospensione viene conservata a -30 °C per successive analisi di microcistine (MC) (Bruno et al., 2012). | + | Circa 5 g di tessuto vengono omogeneizzati per 15 secondi con 10 mL di metanolo (MeOH) al 100% (purezza per HPLC) e centrifugati a 5000 g per 5 minuti. L’estrazione viene ripetuta sul pellet e i surnatanti raccolti vengono quindi filtrati su filtri di carta, i filtrati raggruppati e portati a un volume di 25 mL con MeOH al 100%; 5 mL del volume ottenuto vengono diluiti con 5 mL di acqua distillata e caricati su una cartuccia WatersTM Oasis HLB 6 cc Vac Cartridge precondizionata con 1 mL di MeOH al 100% seguiti da 1 mL di acqua distillata. Il campione viene eluito con 1 mL di MeOH/H2O al 5% e poi raccolto con 1 mL di MeOH. La frazione MeOH al 100% viene essiccata e quindi disciolta in acqua (2 mL). Questa sospensione viene conservata a -30 °C per successive analisi di microcistine (MC) ((Bruno et al., 2012)). |
| ===== 5. Estrazione di cilindrospermopsine da tessuti ittici ===== | ===== 5. Estrazione di cilindrospermopsine da tessuti ittici ===== | ||
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| Il test anti-ADDA (ABRAXIS, USA) è un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, saggio immuno-assorbente legato a un enzima) competitivo indiretto per la rivelazione indipendente di congeneri di microcistine e nodularine. Si basa sul riconoscimento di microcistine, nodularine e loro congeneri per specifici anticorpi. La tossina, se presente in un campione, e un analogo del peptide microcistina immobilizzato sulla piastra, competono per i siti di legame degli anticorpi anti-microcistine/nodularine in soluzione. La piastra viene quindi lavata e viene aggiunto un secondo anticorpo-HRP (Horseradish Peroxidase, enzima perossidasi di rafano). | Il test anti-ADDA (ABRAXIS, USA) è un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, saggio immuno-assorbente legato a un enzima) competitivo indiretto per la rivelazione indipendente di congeneri di microcistine e nodularine. Si basa sul riconoscimento di microcistine, nodularine e loro congeneri per specifici anticorpi. La tossina, se presente in un campione, e un analogo del peptide microcistina immobilizzato sulla piastra, competono per i siti di legame degli anticorpi anti-microcistine/nodularine in soluzione. La piastra viene quindi lavata e viene aggiunto un secondo anticorpo-HRP (Horseradish Peroxidase, enzima perossidasi di rafano). | ||
| - | Dopo una seconda fase di lavaggio e aggiunta del substrato, nella soluzione viene generata una colorazione blu. L’intensità del colore è inversamente proporzionale alla concentrazione di microcistine presenti nel campione. La reazione colorimetrica viene interrotta dopo un tempo specifico e l’intensità del colore viene misurata utilizzando un lettore spettrofotometrico ELISA. Le concentrazioni dei campioni sono determinate da un’interpolazione usando la curva standard costruita con ogni lettura. Il test non distingue tra Microcistina-LR e altre varianti di microcistine, ma rileva la loro presenza globale. Il limite di rivelazione (Limit of Detection, LOD) per questo test, basato su MC-LR, è di 0.10 ppb (μg/L). I coefficienti di variazione (CV%) per gli standard sono inferiori al 10%; per i campioni inferiori al 15%. | + | Dopo una seconda fase di lavaggio e aggiunta del substrato, nella soluzione viene generata una colorazione blu. L’intensità del colore è inversamente proporzionale alla concentrazione di microcistine presenti nel campione. La reazione colorimetrica viene interrotta dopo un tempo specifico e l’intensità del colore viene misurata utilizzando un lettore spettrofotometrico ELISA. Le concentrazioni dei campioni sono determinate da un’interpolazione usando la curva standard costruita con ogni lettura. Il test non distingue tra Microcistina-LR e altre varianti di microcistine, ma rileva la loro presenza globale. Il limite di rivelazione (Limit of Detection, LOD) per questo test, basato su MC-LR, è di 0,10 ppb (μg/L). I coefficienti di variazione (CV%) per gli standard sono inferiori al 10%; per i campioni inferiori al 15%. |
| ==== 7.2. Analisi di cilindrospermopsine ==== | ==== 7.2. Analisi di cilindrospermopsine ==== | ||
