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en:aree:proteomica:ms:linee_guida [2018/02/17 17:08] Gianluca Frustagli created |
en:aree:proteomica:ms:linee_guida [2019/06/18 16:35] (current) Gianluca Frustagli [Polymers] |
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| - | ===== Linee guida ===== | + | ===== Guidelines ===== |
| - | ==== Contaminanti ==== | + | ==== Contaminants ==== |
| - | La spettrometria di massa è una tecnica molto sensibile alla presenza di contaminanti, che se in eccesso potrebbero totalmente invalidare l'analisi. Pertanto è essenziale minimizzare la contaminazione del campione. | + | Mass spectrometry is a technique very sensitive to the presence of contaminants, which if in excess could totally invalidate the analysis. Therefore it is essential to minimize sample contamination. |
| - | ==== Cheratine ==== | + | ==== Keratins ==== |
| - | Le cheratine sono proteine onnipresenti provenienti dalla pelle, capelli, polvere, vestiti, prodotti chimici, etc. La totale eliminazione è praticamente impossibile, ma per evitare la soppressione del segnale delle proteine d'interesse è necessario utilizzare particolari accortezze nella preparazione e manipolazione del campione. Un ambiente di lavoro particolarmente attento è la migliore prevenzione ed è per questo che preferiamo correre/tagliare i gel nel nostro laboratorio. Inoltre, è fortemente consigliato indossare __guanti in nitrile__ senza polvere in ogni momento della preparazione del campione. I __guanti in lattice__ spesso contengono amido, e quindi molte proteine. È preferibile utilizzare __contenitori monouso__ o dedicati (p.es. tubi da centrifuga). Qualora siate voi a preparare i gel, è fondamentale evitare di toccare contenitori e gel con le mani nude; utilizzare contenitori puliti dedicati alla colorazione (e non, ad esempio, quelli utilizzati per Western blot) e chiudere con un coperchio durante la colorazione/storage. In assenza di coperchio __utilizzare carta argentata e **mai** Parafilm__. Non sporgersi sul gel, grattarsi la testa o la barba durante l'interpretazione delle bande ;-) . Se si prende il gel dal contenitore (ad esempio per la scansione, il taglio), pulire accuratamente lo scanner con acqua (__senza sapone!__). Usare sempre soluzioni nuove per preparare e correre gel, inclusi tampone di corsa e sample buffer. È preferibile l’utilizzo di TCEP come riducente piuttosto che b-mercaptoetanolo o DTT. | + | Keratins are ubiquitous proteins from the skin, hair, dust, clothes, chemicals, etc. The total elimination is practically impossible, but to avoid the signal suppression of the proteins of interest it is necessary to use particular precautions in the sample preparation and manipulation. A particularly careful working environment is the best prevention and that's why we prefer to run/cut the gels in our laboratory. Furthermore, it is strongly recommended to wear __nitrile gloves__ without dust at all times of sample preparation. __Latex gloves__ often contain starch, and therefore many proteins. It is preferable to use __single-use or dedicated containers__ (eg centrifuge tubes). |
| - | ==== Altre proteine contaminanti ==== | + | If you decide to prepare gels, it is essential to avoid touching containers and gels with bare hands; use clean containers dedicated to the staining (and not, for example, those used for Western blot) and close with a lid during staining/storage. If there is no cover, __use silver paper and **never** use Parafilm__. Do not lean on the gel, scratch your head or beard during the interpretation of the bands. If you take the gel from the container (eg. for scanning, cutting), thoroughly clean the scanner with water (__no soap!__). Always use new solutions to prepare and run gels, including running buffers and sample buffers. It is preferable to use TCEP as a reducing agent rather than b-mercaptoethanol or DTT. |
| - | Altre proteine osservate spesso sono BSA, immunoglobuline e altre proteine del siero. Questi di solito provengono da terreni di coltura cellulare e possono essere ridotti con ripetuti lavaggi dei pellet cellulari. | + | ==== Other contaminating proteins ==== |
| - | Nel caso di analisi su plasma/siero è necessario utilizzare protocolli specifici per l'eliminazione delle proteine più abbondanti. | + | Other observed proteins are often BSA, immunoglobulins and other serum proteins. These usually come from cell culture media and can be reduced by repeated washing of cell pellets. \\ |
| + | In the case of plasma/serum analysis it is necessary to use specific protocols for the elimination of the most abundant proteins. | ||
| - | ==== Polimeri ==== | + | ==== Polymers ==== |
| - | I polimeri sono i contaminanti più dannosi, poiché oltre a sopprimere il segnale tendono ad attaccarsi alle colonne HPLC o ai capillari, danneggiando il sistema o quantomeno causando un grave effetto memoria sulle successive corse LC-MS. La maggior parte dei polimeri ionizza più facilmente dei peptidi e questo significa che anche piccole quantità possono essere deleterie per l'esperimento. I polimeri più frequentemente osservati sono varie forme di PEG, presenti in alcune plastiche; ma anche in saponi, creme per le mani (__indossare guanti è indispensabile!__) e detergenti. Non è sempre facile rintracciare la fonte di una contaminazione da polimeri, ma una fonte certa è il __Parafilm__, da evitare assolutamente per chiudere tubi o bottiglie di solventi, o vaschette del gel etc. Inoltre, non dovrebbero essere presenti detergenti nei campioni da sottoporre MS, per questo motivo l'analisi è sempre preceduta da PAGE o cromatografia. | + | Polymers are the most harmful contaminants, since in addition to suppressing the signal they tend to stick to HPLC columns or capillaries, damaging the system or at least causing a serious memory effect on subsequent LC-MS strokes. Most polymers ionize peptides more easily and this means that even small amounts can be detrimental to the experiment. The polymers most frequently observed are various forms of PEG, present in some plastics; but also in soaps, hand creams (__wearing gloves is essential!__) and detergents. It is not always easy to trace the source of a contamination from polymers, but a certain source is the __Parafilm__, to avoid absolutely to close tubes or bottles of solvents, or gel trays etc. Furthermore, detergents should not be present in the samples to be subjected to MS, for this reason the analysis is always preceded by PAGE or chromatography. |
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