MassSpec

La spettrometria di massa è una tecnica molto sensibile alla presenza di contaminanti, che se in eccesso potrebbero totalmente invalidare l'analisi. Pertanto è essenziale minimizzare la contaminazione del campione.

Le cheratine sono proteine ​​onnipresenti provenienti dalla pelle, capelli, polvere, vestiti, prodotti chimici, etc. La totale eliminazione è praticamente impossibile, ma per evitare la soppressione del segnale delle proteine d'interesse è necessario utilizzare particolari accortezze nella preparazione e manipolazione del campione. Un ambiente di lavoro particolarmente attento è la migliore prevenzione ed è per questo che preferiamo correre/tagliare i gel nel nostro laboratorio. Inoltre, è fortemente consigliato indossare guanti in nitrile senza polvere in ogni momento della preparazione del campione. I guanti in lattice spesso contengono amido, e quindi molte proteine. È preferibile utilizzare contenitori monouso o dedicati (p.es. tubi da centrifuga). Qualora siate voi a preparare i gel, è fondamentale evitare di toccare contenitori e gel con le mani nude; utilizzare contenitori puliti dedicati alla colorazione (e non, ad esempio, quelli utilizzati per Western blot) e chiudere con un coperchio durante la colorazione/storage. In assenza di coperchio utilizzare carta argentata e mai Parafilm. Non sporgersi sul gel, grattarsi la testa o la barba durante l'interpretazione delle bande . Se si prende il gel dal contenitore (ad esempio per la scansione, il taglio), pulire accuratamente lo scanner con acqua (senza sapone!). Usare sempre soluzioni nuove per preparare e correre gel, inclusi tampone di corsa e sample buffer. È preferibile l’utilizzo di TCEP come riducente piuttosto che b-mercaptoetanolo o DTT.

Altre proteine ​​osservate spesso sono BSA, immunoglobuline e altre proteine ​​del siero. Questi di solito provengono da terreni di coltura cellulare e possono essere ridotti con ripetuti lavaggi dei pellet cellulari.

Nel caso di analisi su plasma/siero è necessario utilizzare protocolli specifici per l'eliminazione delle proteine più abbondanti.

I polimeri sono i contaminanti più dannosi, poiché oltre a sopprimere il segnale tendono ad attaccarsi alle colonne HPLC o ai capillari, danneggiando il sistema o quantomeno causando un grave effetto memoria sulle successive corse LC-MS. La maggior parte dei polimeri ionizza più facilmente dei peptidi e questo significa che anche piccole quantità possono essere deleterie per l'esperimento. I polimeri più frequentemente osservati sono varie forme di PEG, presenti in alcune plastiche; ma anche in saponi, creme per le mani (indossare guanti è indispensabile!) e detergenti. Non è sempre facile rintracciare la fonte di una contaminazione da polimeri, ma una fonte certa è il Parafilm, da evitare assolutamente per chiudere tubi o bottiglie di solventi, o vaschette del gel etc. Inoltre, non dovrebbero essere presenti detergenti nei campioni da sottoporre MS, per questo motivo l'analisi è sempre preceduta da PAGE o cromatografia.