Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR - Biacore)

La SPR è sostanzialmente una bilancia molecolare estremamente sensibile, il cui limite di sensibilità inferiore è di circa 100 Da (circa un aminoacido), riesce a misurare variazioni di pochi pg/mm² che corrispondono a concentrazioni nel range [pM-nM] all’interno della soluzione bulk.

Se una luce polarizzata viene fatta incidere su un sottile strato d’oro, misurando in contemporanea l’intensità del raggio riflesso, in condizioni di riflessione totale, si vede che a un certo angolo di incidenza si verifica un massimo di assorbimento energetico. Tale assorbimento è dovuto al fatto che il “plasmone superficiale” dell’oro (onda superficiale associata agli elettroni di conduzione del metallo) viene messo in risonanza.

Tale plasmone è pertanto molto sensibile a tutto ciò che si trova sulla superficie, basta modificarne debolmente la massa, per esempio a seguito del legame con una molecola per determinare una grossa variazione dell’SPR.

Questo principio viene sfruttato dal Biacore X-100, commercializzato da Cytiva.

Gli elementi fondamentali dello strumento sono:

• Il chip. Descriviamo qui un chip “General Purpose“ di tipo CM (carbossi-metil destrano), ma ne esistono di diverse tipologie per applicazioni specifiche. Un sottile strato d’oro di 50 nm viene stratificato su un supporto di vetro. Sull’altro lato l’oro viene coperto di uno strato idrofobico di alcan tioli. Ed infine sui chip CM da uno strato idrofilico di carbossi-metil destrano. Tale molecola viene tipicamente utilizzata per immobilizzare sul chip ligandi proteici, ss-DNA, Anticorpi, Streptavidina, complessi chelanti. Ma è possibile immobilizzare anche ligandi lipidici, sia sotto forma di monostrato (chip HPA) che di bilayer (chip L1).

• Il sistema microfluidico, consistente in due camere di perfusione e da un complesso sistema di valvole che consentono di perfondere questi due ambienti in modo indipendente. Tipicamente in una prima fase dell’esperimento viene immobilizzato il ligando per il quale si vuole effettuare lo studio in una delle due celle di perfusione (cella 2) mentre l’altra viene utilizzata come cella di riferimento (cella 1).

Una volta effettuata l’immobilizzazione del ligando verrà fatto flussare l’analita posto in un opportuno tampone (sample buffer), questo perfonderà entrambe le celle ma si legherà solo dove sarà stratificato il ligando.

Il legame di una sola molecola di analita al ligando modifica profondamente la risonanza del plasmone di superficie e verrà registrato un segnale la cui intensità sarà riferita alla cella di riferimento (cella 2 - cella 1) e graficato in Responce Units (RU). Tale grafico viene definito sensogramma.

Il protocollo sperimentale viene elaborato grazie ad una interfaccia grafica che dichiara le operazioni che lo strumento dovrà svolgere durante l’esperimento definendo dei Report Point, dei descrittori e dei volumi da iniettare nel circuito fluidico. Una volta definito il protocollo sperimentale e caricati i campioni in un vassoio a revolver l’esperimento può iniziare.

Dopo un certo tempo di perfusione del campione, il sistema effettua un lavaggio con il running buffer durante il quale si ha il distacco delle molecole di analita che hanno interagito con il ligando. Infine, viene flussato un tampone rigenerante tipicamente molto salino e basico che consente di staccare tutte le molecole di analita dal ligando, rendendo disponibile il chip ad un nuovo ciclo di legame-distacco.

Dal sensogramma è possibile evincere sia informazioni cinetiche quali l’associazione e la dissociazione, fittando i dati ottenuti sperimentalmente con dei modelli teorici noti, come pure informazioni di tipo termodinamico (Entalpia, Entropia e Energia libera di Gibbs) legati al fatto che gli esperimenti possono essere fatti a temperatura controllata tra 4 e 45 °C.